Treść zadania

INSTRUKCJA DO ĆWICZEŃ W PRACOWNI SPEKTROFOTOMETRII
Tytuł ćwiczenia nr 1: Charakterystyka spektralna związków absorbujących w zakresie UV-Vis.

I. WSTĘP
Spektrofotometria w zakresie nadfioletu (UV) i światła widzialnego (Vis) należy do najbardziej rozpowszechnionych metod analitycznych. Metoda ta stosowana jest w analizie struktury związków organicznych oraz w analizie ilościowej substancji. Umożliwia odróżnienie układów wiązań sprzężonych od niesprzężonych, identyfikację izomerów geometrycznych cis i trans oraz rozróżnienie izomerów orto, meta i para w związkach aromatycznych. Metoda ta może być stosowana do wyznaczania stałych dysocjacji kwasów i zasad, stałych trwałości kompleksów, a także w badaniach kinetyki reakcji chemicznych.

II. ZAGADNIENIA DO KOLOKWIUM WSTĘPNEGO
1. Charakterystyka promieniowania elektromagnetycznego i jego oddziaływania z materią
2. Struktura i wiązanie chemiczne
 Struktura atomu (liczby kwantowe, orbitalne, zakaz Pauliego, reguła Hunda)
 Wiązanie atomowe (teoria wiązań walencyjnych, teoria orbitali molekularnych)
 Hybrydyzacja: orbitalne sp3, sp2, sp
 Wiązanie atomowe spolaryzowane: elektroujemność, moment dipolowy
 Wiązanie jonowe
3. Przejścia elektronowe w cząsteczkach
4. Absorpcja i prawa absorpcji
5. Drogi powrotu cząsteczki ze stanów wzbudzonych do stanu podstawowego (fluorescencja), tzw. diagram Jabłońskiego

III. Cel ćwiczenia: wykonanie widm absorpcyjnych następujących związków: trypan blue, fluoresceina, erytrozyna A, DAPI

1. Materiały i odczynniki
 Trypan blue, fluoresceina, erytrozyna A, DAPI
 Rozpuszczalniki: woda dejonizowana
2. Sprzęt i aparatura
 Spektrofotometr dla zakresu UV-Vis
 Próbówki (50mL)
 Pipety (10 mL, automatyczne nastawne 100-1000 µL)
 Waga analityczna, płytki plastikowe do odważania, szpatułki

IV. Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować następujące roztwory podstawowe badanych związków:
 Trypanu blue R1 = 0,5 × 10-4 mol/L
 Fluoresceiny o stężeniu R1 = 1 × 10-4 mol/L
 Erytrozyny R1 = 0,85 × 10-4 mol/L
 DAPI o stężeniu R1 = 1 mg/mL
2. Dla przygotowanych roztworów podstawowych nierozcieńczonych wykonać widmo absorpcji
A = f(λ) w kuwetach o grubości warstwy 1 cm w zakresie 200 – 800 nm

Dla trypanu blue przygotować szereg stężeń:
Pobrać 20 mL r-ru R1, dolewać w 5 kolejnych krokach po 2 mL wody (za każdym razem r-r z kuwety pomiarowej wlać z powrotem do próbówki !).

Odnaleźć piki tzn. wyznaczyć długość fali dla których absorbancja jest maksymalna (λmaks ab).


3. Opracowanie i ilustracja otrzymanych wyników
 Przedstawić na wykresach widma absorpcyjne dla badanych luminoforów
 Przedstawić w tabeli długości fali, przy których obserwuje się maksymalną absorbancję λmaks ab
 Wykreślić zależność wartości absorbancji w funkcji stężenia trypanu. Dla zakresu prostoliniowego znaleźć równanie prostej metodą regresji liniowej (wyznaczyć współczynniki a i b prostej).
 W oparciu o wyznaczone parametry krzywej kalibracji wyznaczyć stężenie nieznanego roztworu.
 Obliczyć molowe współczynniki absorpcji ε = A/c*l


V. Literatura
1. Z. Jóźwiak, G.Bartosz; Biofizyka – Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami
2. P.W. Atkins, Chemia fizyczna, Warszawa, PWN 2001.
3. J. McMurry, Chemia organiczna, Warszawa, PWN, 2009.
4. T.Nowicka-Jankowska i inni, Spektrofotometria UV-VIS w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 1988.
http://en.wikipedia.org/wiki/Absorption_(electromagnetic_radiation)
http://en.wikipedia.org/wiki/UV-visible_spectroscopy
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorescenceintro.html
https://www.micro-shop.zeiss.com/?s=2525647761b33&l=en&p=us&f=f